Kao bitan nutrijent, izoleucin se ne sintetizuje u organizmu, zbog čega se mora konzumirati, obično kao sastavni deo proteina. U biljkama i mikroorganizmima, sintetizuje se preko nekoliko karika, počevši od piruvatne kiseline i alfa-ketoglutarata.
U ovu biosintezu su uključeni sledeći enzimi: